三代測序技術：讓你“看清”微生物(wù)基因“骨架”

 近10年來(lái)，腸道微生物(wù)基因組成爲生命科學研究領域的(de)熱(rè)點。然而，目前大(dà)部分(fēn)相關研究，仍使用(yòng)主流二代測序技術進行腸道微生物(wù)種功能解析，宏基因組的(de)拼接質量仍然有較大(dà)提高(gāo)空間，且菌株水(shuǐ)平的(de)功能差異分(fēn)析等領域亟待新的(de)突破。

有鑒于此，中國科學院微生物(wù)研究所王軍研究員(yuán)課題組和(hé)中國科學院動物(wù)研究所宋默識研究員(yuán)課題組合作，利用(yòng)三代納米孔測序技術解析了(le)腸道宏基因組，建立了(le)三代和(hé)二代測序數據混合組裝和(hé)後續分(fēn)析流程。該研究提高(gāo)了(le)宏基因組組裝的(de)質量，以及對(duì)結構變異的(de)發現能力，發現了(le)大(dà)量包括插入突變和(hé)基因倒位在内的(de)結構變異對(duì)于菌株水(shuǐ)平上基因功能的(de)影(yǐng)響，并對(duì)噬菌體等系統進行了(le)深度挖掘，這(zhè)些都是将三代納米孔測序技術用(yòng)于腸道微生物(wù)研究後取得(de)的(de)新進展。該研究論文近日發表在《自然·通(tōng)訊》雜(zá)志上。

不久前，我國首部生物(wù)經濟的(de)五年規劃《“十四五”生物(wù)經濟發展規劃》發布。該規劃明(míng)确指出，加快(kuài)發展高(gāo)通(tōng)量基因測序技術，推動以單分(fēn)子測序爲标志的(de)新一代測序技術創新。而近期，三代測序技術已引發整個(gè)行業的(de)關注，不少企業正積極布局，将其作爲二代測序技術的(de)有效補充，在針對(duì)二代測序範圍外的(de)複雜(zá)基因突變類型進行測序方面尋求新的(de)解決方案。

兩代測序技術聯手探索腸道微生物(wù)

人(rén)類的(de)腸道是細菌、真菌等微生物(wù)的(de)家園，這(zhè)些微生物(wù)被統稱爲腸道微生物(wù)群。科學家們現在已經收集了(le)人(rén)類腸道中4600多(duō)種細菌的(de)20萬個(gè)基因組和(hé)1.7億個(gè)蛋白質序列，并建立了(le)數據庫。

盡管科學家長(cháng)期緻力于這(zhè)一領域的(de)研究，但腸道菌群中的(de)一些微生物(wù)種類在很長(cháng)時(shí)間内不爲人(rén)所知。據估計，人(rén)體内含有的(de)微生物(wù)數量比人(rén)體細胞還(hái)多(duō)。在人(rén)類腸道中已經發現了(le)共計4600餘種細菌。有研究表明(míng)，這(zhè)其中超過70%的(de)被檢測到的(de)細菌還(hái)未在實驗室中培養，它們在人(rén)體内的(de)活性仍然未知。

“在人(rén)的(de)腸道中，尤其是在直腸裏，有非常豐富的(de)微生物(wù)，個(gè)體數量超過人(rén)體細胞的(de)3—10倍。雖然這(zhè)些微生物(wù)種的(de)基因組較小，但由于種類很多(duō)，其基因多(duō)樣性比人(rén)高(gāo)10—100倍。”王軍告訴記者，腸道微生物(wù)群落形成了(le)一個(gè)非常複雜(zá)的(de)腸道環境，對(duì)其進行研究有助于了(le)解腸道的(de)狀态和(hé)功能，從而更好地了(le)解人(rén)體和(hé)疾病，指導胃腸道疾病的(de)診斷和(hé)治療。

宋默識表示，腸道微生物(wù)在人(rén)類代謝食物(wù)、抵禦感染和(hé)應答(dá)藥物(wù)等過程中起著(zhe)非常重要的(de)作用(yòng)。腸道維持著(zhe)人(rén)體的(de)代謝平衡，很多(duō)食物(wù)會在腸道内最終降解成小分(fēn)子最終代謝物(wù)。如果腸道微生物(wù)生态系統失衡，将導緻代謝功能失調，造成胃腸道疾病。同時(shí)，一些腸道免疫性疾病（如炎症性腸炎）也(yě)與腸道微生物(wù)生态系統的(de)免疫調節相關。因此，腸道微生物(wù)群一直是科學家們最關注的(de)議(yì)題之一。

但受研究方法的(de)限制，相關研究一直進展較慢(màn)。

“以前，相關研究依靠低通(tōng)量的(de)微生物(wù)群培養手段。但随著(zhe)二代測序技術的(de)發展，能夠使我們以較高(gāo)通(tōng)量的(de)方法去了(le)解腸道微生物(wù)種。近年來(lái)，三代測序技術發展迅速，又彌補了(le)二代測序技術的(de)一些不足，兩者相結合，爲探索腸道微生物(wù)種提供了(le)較好的(de)方法條件。”王軍說。

三代測序是二代測序的(de)有益補充

王軍向記者介紹，以納米孔測序爲代表的(de)三代測序技術飛(fēi)速發展，目前英國ONT測序和(hé)美(měi)國PacBio測序兩種技術路線，都能夠完成較長(cháng)的(de)DNA片段測序。

三代測序技術較二代測序技術有何不同？

在研究中，王軍課題組使用(yòng)了(le)二代測序與三代測序數據組裝拼接的(de)辦法。“引入三代測序能夠彌補二代測序‘序列短’這(zhè)一不足。三代測序讀出的(de)長(cháng)序列就像一個(gè)‘骨架’，能夠讓研究者知道二代測序讀出來(lái)的(de)短片段之間有什(shén)麽對(duì)應關系，該怎樣拼接，從而提高(gāo)整體基因拼接序列的(de)質量，提高(gāo)對(duì)某個(gè)生物(wù)染色體的(de)全面認識。”王軍說。

對(duì)此，王軍表示，二代測序技術是目前的(de)主流測序方式，已廣泛應用(yòng)于疾病和(hé)癌症的(de)研究，具有高(gāo)通(tōng)量的(de)特點，但不足之處在于測出來(lái)的(de)基因片段較短，對(duì)于複雜(zá)的(de)基因組區(qū)域以及較大(dà)的(de)結構變異的(de)檢測有一定的(de)局限性。而三代測序技術則能夠幫助研究者針對(duì)感興趣的(de)基因或區(qū)域進行高(gāo)深度測序研究。目前，三代測序技術已被應用(yòng)于疾病或癌症領域人(rén)類基因遺傳标志物(wù)、融合基因、甲基化(huà)檢測等研究中，方法主要有長(cháng)片段PCR擴增、CRISPR/Cas9靶向捕獲和(hé)液相探針捕獲三類。

在三代測序方法出現之前，研究者利用(yòng)二代測序技術拼出大(dà)大(dà)小小的(de)不同基因片段，但常常無法知道某些片段屬于哪個(gè)菌種。王軍表示，雖然存在一些計算(suàn)方法使研究者可(kě)以依據峰段、頻(pín)率去推斷基因片段之間的(de)關系，但由于缺乏直接證據，這(zhè)一研究難題仍無法得(de)到根本解決。

“三代測序技術改變了(le)這(zhè)一情況。将三代測序技術得(de)出的(de)數據與二代的(de)進行混合拼接，就能夠在很複雜(zá)的(de)環境中幾乎接近拼出一個(gè)細菌的(de)單個(gè)基因組。”王軍說。

三代測序技術未來(lái)還(hái)有更大(dà)發展空間

近年來(lái)，全球實驗室都開始大(dà)規模應用(yòng)三代測序技術。

“每一個(gè)新測序技術剛出來(lái)的(de)時(shí)候一般都很貴，大(dà)家都覺得(de)是在‘燒錢’做(zuò)研究。”王軍向記者介紹，盡管三代測序技術爲精細探索基因功能提供了(le)新的(de)路徑，但其經濟性仍不高(gāo)，“三代測序技術的(de)單位測序數據成本比二代要高(gāo)很多(duō)。每次測序非常貴，一次出來(lái)的(de)數據量約爲二代的(de)1/10，有時(shí)甚至還(hái)不到二代的(de)3%。數據量少的(de)特性是由三代測序技術的(de)原理(lǐ)決定的(de)。”

在充斥著(zhe)電解液的(de)容器中，放置鑲嵌有納米孔蛋白的(de)分(fēn)子膜。在相關蛋白質和(hé)酶的(de)輔助下(xià)，DNA分(fēn)子以較爲穩定的(de)速度通(tōng)過納米孔，當納米孔内被特定的(de)核苷酸占據時(shí)，會對(duì)孔周圍的(de)電流産生擾動。通(tōng)過記錄DNA分(fēn)子通(tōng)過納米孔過程中産生的(de)電流信号情況，再将這(zhè)一特異性的(de)電信号序列利用(yòng)算(suàn)法軟件翻譯爲核苷酸序列，這(zhè)就是三代測序技術的(de)基本操作原理(lǐ)。

“目前的(de)工藝決定了(le)三代測序技術測出的(de)數據量偏少。”王軍說，但其與二代測序技術相結合，能爲建立更高(gāo)質量的(de)基因圖譜作出貢獻。

下(xià)一步，三代測序技術還(hái)有哪些發展空間？

在王軍看來(lái)，開發序列信息解讀算(suàn)法是一個(gè)發展方向。如何精确地将新一代基于納米孔的(de)單分(fēn)子實時(shí)電信号測序技術生成的(de)原始電信号翻譯爲序列信息，是科學家們關注的(de)重點，近年來(lái)也(yě)誕生了(le)多(duō)種用(yòng)于精确翻譯電信号的(de)相關工具。

“三代測序技術暫時(shí)取代不了(le)二代測序技術，但在未來(lái)，它将成爲測序技術不可(kě)缺少的(de)組成部分(fēn)，在甲基化(huà)檢測等獨特領域實現其重要價值。”王軍說。

同時(shí)，三代測序技術還(hái)能在甲基化(huà)檢測等特殊領域發揮重要作用(yòng)。三代測序技術能夠檢測DNA分(fēn)子自身的(de)物(wù)理(lǐ)化(huà)學特性，因此生物(wù)基因組上的(de)修飾信息也(yě)可(kě)以在電信号中得(de)到反應。DNA分(fēn)子上的(de)甲基化(huà)修飾具有非常強的(de)細胞特異性和(hé)細胞周期特異性，對(duì)表觀遺傳學研究有著(zhe)重要的(de)意義。